Definisi penyakit
: Bovine Anaplasmosis merupakan penyakit yang disebabkan karena infeksi
anaplasma marginale. Spesies kedua, anaplasma central, telah lama dikenal dan
biasa menyebabkan infeksi ringan. Anaplasma marginale bertanggung jawab untuk
hampir semua wabah penyakit klinis. Anaplasma phagocytophilum dan A. bovis, yang menginfeksi
ternak, baru-baru ini termasuk dalam genus namun tidak dilaporkan menyebabkan
penyakit klinis. Organisme ini diklasifikasikan dalam genus Anaplasma pada
family Anaplasmataceae order Rickettsiales.
Deskripsi penyakit
: anemia, penyakit kuning dan kematian mendadak adalah tanda menciri
anaplasmosis. Tanda-tanda lainnya termasuk hilangnya produksi susu dan berat
badan, tetapi penyakit klinis ini hanya dapat dikonfirmasi dengan
mengidentifikasi organisme. Setelah terinfeksi, ternak yang hidup
mungkin dapat menjadi carrier, dan identifikasi hewan-hewan ini bergantung pada
deteksi antibody spesifik menggunakan tes serologis, tes DNA rickettsia menggunakan
teknik amplifikasi molecular. Penyakit ini biasanya ditularkan oleh vector
kutu, tetapi transmisi mekanik dengan menggigit serangga atau dengan jarum
dapat terjadi.
Identifikasi agen: pemeriksaan mikroskopik ulas darah atau organ
diwarnai dengan pewarnaan Giemsa adalah metode yang paling umum untuk
identifikasi Anaplasma pada hewan yang memiliki gejala klinis. Pada ulasan ini,
A. marginale terlihat padat, bulat, diameter intraeritrositik bodies sekitar
0.3–1.0 μm terletak di dalam atau didekat margin eritrosit. Anaplasma
central mempunyai kemiripan bentuk, namun sebagian besar organisme terletak di
tengah sel eritrosit. Sulit untuk membedakan A. Marginale dari A. Centrale pada
pewarnaan ulasan, terutama dengan rendahnya tingkat rickettsaemia.
Pewarnaan komersial yang memberi pewarnaan cepat terhadap Anaplasma tersedia di
beberapa Negara. Anaplasma phagocytophilum and A.
bovis hanya dapat diamati apabila ada infeksi granulosit, terutama neutrofil.
Penting bahwa ulasan harus dipersiapkan dengan baik dan
bebas dari benda asing. Ulasan dari ternak hidup sebaiknya dibuat dari darah yang diambil dari vena
jugularis atau pembuluh darah besar lainnya. Untuk diagnosis post mortem,
ulasan sebaiknya disiapkan dari organ dalam (termasuk hati, ginjal, jantung
paru) dan darah yang diambil dari pembuluh darah perifer. Yang terakhir sangat
diharapkan jika dekomposisi post mortem berlanjut.
Tes
serologis: enzyme-linked
immunosorbent assay kompetitif (C-ELISA) telah terbukti memiliki sensitivitas
yang baik untuk mendeteksi hewan carier. Card agglutination adalah tes
berikutnya yang sering digunakan. complement fixation test (CFT)
tidak lagi dianggap sebagai tes yang
dapat diandalkan untuk sertifikasi penyakit pada individu hewan karena
sensitivitasnya berubah-ubah. Reaksi silang antara Anaplasma spp dapat
mempersulit interpretasi pada tes serologis. Secara umum, C-ELISA memiliki
spesifisitas paling baik, dengan reaktivitas silang yang digambarkan antara A.
marginale, A. centrale, A. phagocytophilum and Ehrlichia spp. Kemungkinan lain, indirect ELISA menggunakan
CFT dengan modifikasi adalah tes handal yang digunakan di banyak laboratorium
dan dapat disiapkan sendiri sebagai diagnosa rutin anaplasmosis.
Tes berbasis asam nukleat
telah digunakan secara eksperimental, dan mampu mendeteksi adanya infeksi
tingkat rendah pada ternak carrier dan vector kutu. Nested Reaction dibutuhkan
untuk mengidentifikasi pembawa tingkat rendah menggunakan polymerase chain
reaction konvensional (PCR) dan dapat terjadi amplifikasi non spesifik. Baru-baru
ini, real-time PCR dengan sensitivitas analisis setara dengan nested PCR
konvensional seperti yang telah dijelaskan.
Persyaratan
untuk vaksin: vaksin Live digunakan di beberapa
negara untuk melindungi ternak terhadap infeksi A. marginale. Sebuah vaksin
yang terdiri dari A. centrale hidup yang paling banyak digunakan dan memberikan
perlindungan parsial terhadap tantangan dengan virulen A. marginale.
Vaksin Anaplasma centrale disediakan
dalam bentuk dingin atau beku. Kontrol kualitas sangat penting sebagai agen
darah lainnya yang mungkin ada pada sapi donor dapat mencemari vaksin dan
disebarluaskan. Untuk alasan ini, vaksin beku dianjurkan karena memungkinkan
kontrol menyeluruh kualitas pasca-produksi, yang membatasi risiko kontaminasi
dengan patogen lainnya.
Vaksin Anaplasma centrale tidak
sepenuhnya aman. Rekomendasi yang praktis yaitu untuk membatasi penggunaannya,
sejauh mungkin, untuk anak sapi, sebagai imunitas nonspesifik akan meminimalkan
risiko beberapa reaksi vaksin yang mungkin memerlukan pengobatan dengan
tetrasiklin atau imidocarb. Kekebalan parsial berkembang dalam 6-8 minggu dan
berlangsung selama beberapa tahun setelah vaksinasi tunggal. Di negara-negara
di mana A. centrale eksotis, tidak dapat digunakan sebagai vaksin terhadap A.
marginale.
A. PENDAHULUAN
Wabah
anaplasmosis pada sapi adalah karena infeksi Anaplasma marginale. Anaplasma
centrale mampu memproduksi anemia tingkat moderat, namun wabah klinis di
lapangan sangat langka. spesies baru Anaplasma, A. phagocytophilum dan A. bovis (Dumler et al, 2001), dengan reservoir utama
pada hewan pengerat, telah dilaporkan menginfeksi ternak, tetapi tidak
menyebabkan penyakit klinis (Dreher et al, 2005;. Hofmann -Lehmann et al.,
2004).
tanda-tanda
klinis yang paling menciri dari anaplasmosis adalah anemia dan penyakit kuning,
yang terakhir terjadi pada akhir penyakit. Haemoglobinaemia dan haemoglobinuria
tidak tampak, ini dapat membantu dalam diferensial diagnosis anaplasmosis dari
Babesiosis, yang sering endemik terjadi di daerah yang sama. Penyakit ini hanya
bisa dikonfirmasi dengan identifikasi organisme.
Anaplasma marginale paling sering terjadi di
negara-negara tropis dan subtropis, dan di beberapa daerah beriklim. Anaplasma
centrale pertama kali muncul dari Afrika Selatan. Sejak itu organisme tersebut diimpor
oleh negara-negara lain - termasuk Australia dan beberapa negara di Amerika
Selatan, Asia Tenggara dan Timur Tengah - untuk digunakan sebagai vaksin
terhadap A. marginale.
Spesies
Anaplasma awalnya dianggap sebagai parasit protozoa, tetapi penelitian lebih
lanjut menunjukkan mereka tidak memiliki atribut yang signifikan untuk
menjustifikasi deskripsi ini. karena telah terjadi perubahan taksonomi pada
tahun 2001 (Dumler et al., 2001), Keluarga Anaplasmataceae (Order
Rickettsiales) kini terdiri dari empat genera, Anaplasma, Ehrlichia,
Neorickettsia, dan Wolbachia. Genus Aegyptianellais dipertahankan dalam Keluarga
Anaplasmataceae sebagai genus Incertae sedis. genus Anaplasma revisi sekarang
berisi Anaplasma marginale, A. phagocytophilum agen dari human granulocytic
ehrlichiosis (sebelumnya Ehrlichia phagocytophila dan E. equi) A. platys, dan
A. bovis. Haemobartonella dan Eperythrozoon sekarang dianggap berkaitan erat
dengan mycoplasmas.
Spesies
Anaplasma ditularkan baik secara mekanis atau biologis oleh vektor arthropoda.
Ulasan berdasarkan studi yang cermat percobaan transmisi melaporkan daftar
sampai dengan 19 kutu berbeda mampu menularkan A. marginale (Kocan et al.,
2004). Antara lain: Argas persicus, Ornithodoros lahorensis, Dermacentor
albipictus, D. andersoni, D. hunteri, D. occidentalis, D. variabilis, Hyalomma
ekskavatum, H. rufipes, ixodes ricinus, I. scapularis, Rhipicephalus annulatus
(sebelumnya Boophilus annulatus), R. bursa, R. calcaratus, R. decoloratus, R.
evertsi, R. MicroPlus, R. sanguineus dan R. simus. Namun, klasifikasi beberapa
kutu dalam laporan ini dipertanyakan. Cara transmisi yang biasa adalah transmisi
Intrastadial atau transstadial, bahkan dalam satu host spesies Rhipicephalus.
kutu jantan mungkin sangat penting sebagai vektor; mereka dapat menjadi infeksi
persisten dan berfungsi sebagai reservoir untuk infeksi. demonstrasi
eksperimental kompetensi vektor tidak selalu berarti dalam perannya dalam transmisi
di lapangan. Namun, spesies Rhipicephalus adalah vektor penting dari
anaplasmosis di negara-negara seperti Australia dan negara-negara di Afrika,
dan Amerika Latin, dan beberapa spesies Dermacentor adalah vektor-vektor
efisien di Amerika Serikat (USA).
Berbagai
arthropoda menggigit lainnya telah terlibat sebagai vektor mekanik, terutama di
Amerika Serikat. transmisi eksperimental telah ditunjukkan dengan sejumlah
spesies Tabanus (lalat), dan dengan nyamuk dari genus Psorophora (Kocan et al.,
2004). Pentingnya serangga menggigit dalam transmisi alami anaplasmosis
tampaknya sangat bervariasi dari daerah ke daerah. Anaplasma marginale juga
dapat dengan mudah ditularkan selama vaksinasi terhadap penyakit lainnya
kecuali jarum segar atau disterilkan yang digunakan untuk menyuntikkan setiap
binatang. transmisi serupa dengan cara instrumen bedah yang tidak disterilisasi
telah dijelaskan (Reinbold et al., 2010a).
Vektor
biologis utama A. centrale tampak seperti kutu multihost endemik di Afrika, termasuk R. simus. Secara
umum kutu ternak (R. MicroPlus) belum terbukti sebagai vektor. Hal ini relevan
dimana A. centrale digunakan sebagai vaksin di daerah terinfeksi R.MicroPlus.
Infeksi Anaplasma marginale belum dilaporkan pada manusia. Dengan demikian,
tidak ada resiko lapangan atau transmisi laboratorium kepada pekerja dan
pekerja laboratorium yang bekerja dengan A. marginale dapat beroperasi pada
tingkat keamanan hayati terendah, setara dengan BSL1.
B. TEKNIK DIAGNOSTIK
Table. 1 metode uji yang tersedia untuk mendiagnosa bovine anaplasmosis dan
tujuannya.
Metode
|
Tujuan
|
|||||
Populasi yang bebas dari
infeksi
|
Kebebasan individu hewan
sebelum ada gerakan
|
Kontribusi dalam
kebijakan pemberantasan
|
Konfirmasi kasus klinis
|
Prevalensi
infeksi-surveilans
|
Status imun pada
individu hewan atau populasi pasca vaksinasi
|
|
Pemeriksaan mikroskopis
|
-
|
+
|
-
|
+++
|
-
|
-
|
Identifikasi Agen1
|
||||||
PCR
|
-
|
+++
|
-
|
+++
|
-
|
-
|
Deteksi respon imun2
|
||||||
CAT
|
–
|
–
|
–
|
–
|
+-
|
+
|
ELISA
|
+++
|
+
|
+++
|
–
|
+++
|
+++
|
IFAT
|
+
|
–
|
–
|
–
|
++
|
++
|
CFT
|
–
|
–
|
–
|
–
|
+
|
-
|
Key: +++ = metode yang direkomendasikan; ++ = metode
yang sesuai; + = dapat digunakan dalam beberapa situasi, tetapi biaya,
kehandalan, atau faktor-faktor lain sangat membatasi penerapannya; – = tidak
sesuai untuk tujuan ini. Meskipun tidak semua tes terdaftar sebagai kategori
+++ or ++ telah mengalami validasi formal, sifat rutin mereka dan fakta bahwa
mereka telah digunakan secara luas tanpa hasil yang meragukan, membuat mereka
dapat diterima. Agent id. = agent
identification; CAT = card agglutination test; CFT = complement fixation test;
ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay; IFAT = indirect fluorescent antibody
test; PCR = polymerase chain reaction.
1. Identifikasi
Agen
1.1. Pemeriksaan
mikroskopik
Sampel dari sapi harus mencakup
ulasan darah tipis dan darah dikumpulkan ke dalam antikoagulan. ulasan darah tipis
yang telah dikeringkan dapat disimpan dengan baik pada suhu kamar selama
minimal 1 minggu. Sampel darah dalam antikoagulan harus tetap disimpan pada
suhu 4 ° C, kecuali ia dapat mencapai laboratorium dalam beberapa jam. Sampel
ini berguna untuk mempersiapkan smear segar jika yang disampaikan tidak
memuaskan. Selain itu, PCV yang rendah dan / atau penghitungan eritrosit dapat
membantu untuk membuktikan keterlibatan A. marginale ketika hanya sejumlah
kecil parasit terdeteksi di ulasan, misalnya selama tahap pemulihan dari
penyakit.
Berbeda dengan Babesia bovis
, A. marginale tidak menumpuk di pembuluh/ kapiler, sehingga sebaiknya darah
diambil dari vena jugularis atau pembuluh darah besar lainnya. Karena morfologi
dari Anaplasma tidak menciri, perlu disiapkan ulasan darah yang baik dan bebas
dari benda asing, seperti bintik-bintik debris dapat membingungkan diagnosis.
Film darah yang tebal terkadang digunakan untuk diagnosis Babesiosis tidak
sesuai untuk diagnosis anaplasmosis,seperti Anaplasma sulit untuk diidentifikasi setelah dipisahkan dari
eritrosit.
Sampel dari hewan mati harus mencakup ulasan tipis dari hati,
ginjal, jantung dan paru-paru dan dari pembuluh darah perifer. Yang terakhir
sangat direkomendasikan harus ada penundaan sebelum pemeriksaan post-mortem
karena, dalam situasi seperti ini, kontaminasi bakteri dari apusan organ sering
membuat identifikasi Anaplasma menjadi samar. ulasan otak, yang berguna untuk
diagnosis beberapa bentuk Babesiosis, tidak langsung dapat mendiagnosis
anaplasmosis, tetapi harus dimasukkan untuk diagnosis diferensial mana yang
sesuai.
Darah dari organ, daripada jaringan organ per se, diperlukan untuk
persiapan ulasan , tujuannya adalah untuk memeriksa secara mikroskopis
eritrosit utuh terhadap adanya
Anaplasma. ulasan darah-organ dapat disimpan secara baik pada suhu kamar selama
beberapa hari.
Keduanya darah dan ulasan organ dapat diwarnai dengan 10% Giemsa stain selama
kurang lebih 30 menit setelah fiksasi dalam metanol absolut selama 1 menit.
Setelah pewarnaan, ulasan dibilas tiga atau empat kali dengan air keran untuk
membuang kelebihan noda, dan kemudian dikeringkan. Kondisi untuk pewarnaan
Giemsa bervariasi dari laboratorium ke laboratorium, tetapi air suling tidak
dianjurkan untuk dilusi stok Giemsa. Air harus pada pH 7,2-7,4 untuk mencapai
resolusi terbaik dengan pewarnaan Giemsa. Pewarnaan komersial memberikan pewarnaan
yang sangat cepat dan pewarnaan Anaplasma tersedia di beberapa negara. Ulasan
diperiksa di bawah minyak imersi pada perbesaran × 700-1000.
Anaplasma marginale tampak padat, bulat
dan terdapat badan intraerythrocytic yang sangat terwarnai, dengan diameter sekitar
0,3-1,0 μm. Sebagian besar badan ini terletak di atau dekat margin eritrosit. ciri
ini membedakan antara A. marginale dari A. centrale, seperti kebanyakan dari
organisme tersebut memiliki lokasi yang lebih sentral dalam eritrosit. Namun,
terutama pada rickettsaemia tingkat rendah, membedakan dua spesies pada ulasan
ini bisa sulit. Perlekatan terkait dengan badan Anaplasma telah dijelaskan
dalam beberapa isolat A. marginale. (Kreier & Ristic, 1963;. Stich et al,
2004)
Persentase eritrosit yang terinfeksi
bervariasi dengan tahap dan tingkat keparahan penyakit. Rickettsaemias maksimum
lebih dari 50% dapat terjadi dengan A. marginale. Beberapa infeksi eritrosit
individu yang umum selama periode rickettsaemias tinggi.
Infeksi menjadi terlihat secara
mikroskopis pada 2-6 minggu setelah transmisi. Selama penyakit klinis ini
berjalan, rickettsaemia muncul sekitar dua kali lipat setiap hari sampai
sekitar 10 hari, dan kemudian menurun pada tingkat yang sama. Anemia berat
dapat bertahan selama beberapa minggu setelah parasit telah menjadi hampir tidak
terdeteksi dalam apusan darah. Setelah sembuh dari infeksi awal, sapi selama
hidupnya tetap terinfeksi secara laten.
1.2. Polymerase Chain Reaction
Tes berbasis asam nukleat untuk
mendeteksi infeksi A. marginale pada ternak carrier telah dikembangkan meskipun
belum sepenuhnya divalidasi. Sensitivitas analitis metode polymerase chain
reaction (PCR) telah diperkirakan 0,0001% eritrosit yang terinfeksi, tetapi
pada tingkat ini hanya sebagian ternak pembawa yang akan terdeteksi. Nested PCR
telah digunakan untuk mengidentifikasi A. marginale pada ternak carrier dengan
kemampuan mengidentifikasi sedikitnya 30 eritrosit yang terinfeksi per ml
darah, jauh di bawah tingkat terendah dari pembawa. Namun, nested PCR menunjukkan
kontrol kualitas yang signifikan dan permasalahan spesifisitas untuk penggunaan
rutin (Torioni De Echaide et al., 1998). Real-time PCR juga telah dijelaskan
untuk identifikasi A. marginale (Carelli et al, 2007;.. DeCaro et al, 2008;.
Reinbold et al, 2010b), dan seharusnya dianggap bukan nested PCR. Dua
keuntungan dari teknik ini, yang menggunakan tabung tertutup tunggal untuk
amplifikasi dan analisis, kemungkinan kecil kontaminasi amplikon dan hasil tesnya
semi kuantitatif. Peralatan yang dibutuhkan untuk real-time PCR mahal,
memerlukan pemeliharaan preventif, dan mungkin di luar kemampuan beberapa
laboratorium. Real-time PCR dapat menargetkan satu dari beberapa gen (Carelli
et al, 2007;.. DeCaro et al, 2008), atau 16S rRNA (Reinbold et al, 2010b.), dan
dilaporkan untuk mencapai tingkat sensitivitas analitis setara dengan nested PCR
konvensional (Carelli et al, 2007;.. DeCaro et al, 2008;. Reinbold et al,
2010b).
2. Tes Serologis
Secara umum, kecuali pada hewan yang telah
diberi perlakuan atau berada pada tahap awal infeksi ( <14 hari), serologi
menggunakan enzim-linked immunosorbent assay kompetitif (C-ELISA), indirect ELISA (I-ELISA) atau card agglutination test (CAT)
(lihat di bawah) mungkin merupakan metode yang disukai untuk mengidentifikasi
hewan yang terinfeksi di sebagian besar laboratorium . Pada hewan, infeksi
Anaplasma biasanya tetap bertahan hidup. Namun, kecuali untuk kejadian kambuh
dan muncul gejala klinis kembali itu sangat kecil sesekali, Anaplasma tidak dengan
mudah terdeteksi dalam apusan darah setelah rickettsaemia akut dan bahkan end-point PCR mungkin
tidak dapat mendeteksi keberadaan Anaplasma dalam sampel darah dari pembawa
asimtomatik. Dengan demikian, sejumlah tes serologi telah dikembangkan dengan
tujuan mendeteksi hewan dengan infeksi persisten.
Ciri dari diagnosis secara serologis
anaplasmosis adalah hasil yang sangat bervariasi berkaitan dengan kedua
sensitivitas dan spesifisitas yang dilaporkan untuk banyak tes dari
laboratorium yang berbeda. Hal ini disebabkan setidaknya bagian evaluasi tidak
memadai terhadap tes dengan menggunakan sejumlah besar hewan yang diketahui positif
dan negatif. Yang terpenting, kapasitas beberapa tes untuk mendeteksi infeksi yang
dikenal durasi lama disebut tidak cukup. Pengecualian adalah C-ELISA (lihat di
bawah), yang telah divalidasi menggunakan hewan dengan true positif dan negatif
didefinisikan oleh nested PCR (Torioni De Echaide et al., 1998), dan uji card agglutination, yang sensitivitas dan spesifisitas relatif dibandingkan dengan
C-ELISA telah dievaluasi (Molloy et al., 1999). Oleh karena itu, meskipun sebagian
besar tes diuraikan dalam bagian ini berguna untuk memperoleh data epidemiologi
berbasis luas, disarankan hati-hati penggunaannya untuk sertifikasi penyakit.
C-ELISA, I-ELISA dan CAT dijelaskan secara rinci di bawah ini.
Yang perlu dicatat bahwa ada reaksi
silang tingkat tinggi antara A. marginale dan A. centrale, serta reaktivitas
silang dengan kedua A. phagocytophilum dan Ehrlichia spp. dalam tes serologis
(Al-Adhami et al, 2011;.. Dreher et al, 2005). Sementara spesies yang menginfeksi
kadang-kadang dapat diidentifikasi dengan menggunakan antigen dari spesies
homolog dan heterolog, hasil samar-samar diperoleh pada banyak kesempatan.
2.1. Competitive
Enzyme-linked immunosorbent assay
A C-ELISA menggunakan antigen
rekombinan yang disebut rMSP5 dan antibodi monoklonal MSP5-spesifik (MAb) telah
terbukti sangat sensitif dan spesifik untuk deteksi hewan terinfeksi Anaplasma
(Hofmann- Lehmann et al, 2004;.. Reinbold et al, 2010b;. Strik et al, 2007).
Semua strain A. marginale yang diuji, bersama dengan A. Ovis dan A. centrale,
mengekspresikan antigen MSP5 dan menimbulkan serangan antibodi terhadap epitop
imunodominan dikenal dengan MSP5-specific MAb. Sebuah laporan
terbaru menunjukkan bahwa antibodi dari ternak eksperimental terinfeksi A.
phagocytophilum akan teruji positif di C-ELISA (Dreher et al., 2005). Namun,
dalam studi lain tidak ada reaktivitas silang yang bisa ditunjukkan, dan MAb
yang digunakan dalam pengujian tersebut tidak bereaksi dengan A.
phagocytophilum MSP5 pada uji ikatan langsung (Strik et al., 2007). Reaksi
silang telah dibuktikan antara A. marginale dan Ehrlichia spp, pada sapi yang
terinfeksi secara alami dan eksperimental (Al-Adhami et al, 2011). Penelitian sebelumnya
telah menunjukkan bahwa C-ELISA adalah 100% spesifik menggunakan 261 yang
diketahui sera negatif dari daerah
non-endemik, mendeteksi ternak secara akut terinfeksi sejak 16 hari setelah diinfeksikan
kutu atau inokulasi darah, dan ditunjukkan untuk mendeteksi ternak yang telah secara
eksperimental terinfeksi selama 6 tahun sebelumnya (Knowles et al., 1996).
Dalam mendeteksi sapi dengan infeksi persisten dari daerah endemik anaplasmosis
yang didefinisikan sebagai true positif atau negatif menggunakan prosedur nested
PCR, rMSP5 C-ELISA memiliki sensitivitas 96% dan spesifisitas 95% (Torioni De
Echaide et al.,1998).
hasil tes menggunakan rMSP5 C-ELISA
dapat diketahui dalam waktu kurang dari 2,5 jam. Sebuah test kit yang tersedia
secara komersial berisi petunjuk khusus. Secara umum, kiranya uji tersebut
dilakukan sebagai berikut.
2.1.1. Reagen kit
Plate
dengan 96-well µL yang dicoating dengan antigen rMSP5,
Plate
dengan 96-well coated adsorption/plate transfer untuk menyerap serum untuk
mengurangi ikatan pada latar belakang,
100×MAb/peroxidase
conjugate,
10×
wash solution dan conjugate-diluting buffer siap pakai,
Substrate
dan stop solutions siap pakai,
Kontrol Positif and negatif
2.1.2. Prosedur Uji
i.
tambah 70 μl serum sampel
undiluted ke coated adsorption/plate transfer dan inkubasi pada suhu ruang
selama 30 menit.
ii.
Transfer 50 μl tiap well dari serum yang diadsorpsi ke dalam plate
rMSP5-coated dan inkubasi pada suhu ruang selama 60 menit.
iii.
buang serum dan cuci plate dua
kali menggunakan diluted wash solution.
iv.
tambahkan pada setiap well 50
μl konjugat 1× diluted MAb/peroxidase ke plate rMSP5-coated dan inkubasi pada
suhu ruang selama 20 menit.
v.
buang konjugat 1×diluted
MAb/peroxidase dan cuci plate sebanyak 4 kali menggunakan diluted wash
solution.
vi.
Tambah pada setiap well 50 μl
substrate solution, tutup plate dengan foil, dan inkubasi selama 20menit pada
suhu ruang.
vii.
Tambah pada setiap well 50 μl
stop solution ke dalam substrat solution yang sudah tersedia pada well tersebut
dan tekan secara perlahan sisi dari plate untuk mencampur well.
viii.
Segera baca plate pada plate
reader pada gelombang 620 nm.
2.1.3. Validasi Uji
Rata-rata
optical density (OD) pada control negative harus antara 0,40 sampai 2,10.
Persen inhibisi positif kontrol harus ≥30%.
2.1.4. interpretasi hasil
Persentase
inhibisi dapat dihitung sebagai berikut:
100
|
-
|
=
|
% Inhibisi
|
|
xRata-rata OD kontrol Negatif
|
Sampel
dengan inhibisi <30% adalah negatif. Sampel dengan inhibisi ≥30% adalah
positif.
Spesifisitas C-ELISA MSP5 dapat
ditingkatkan dengan menggunakan persentase yang lebih tinggi nilai inhibition
cut-off (Bradway et al, 2001.); Namun
efek dari perubahan sensitivitas belum dievaluasi secara menyeluruh.
Baru-baru ini, perbaikan C-ELISA MSP5
dikembangkan dengan mengganti rMBP-MSP5 dengan rGST-MSP5 selain perbaikan dalam
metode antigen-coating dengan menggunakan specific catcher system. Metode C-ELISA rMSP5-GST yang baru lebih cepat, sederhana,
memiliki spesifisitas dengan tingkatan yang lebih tinggi dan perbaikan resolusi
dibandingkan dengan rMSP5-MBP C-ELISA dengan adsorpsi MBP (Chung et al., 2014).
2.2. Indirect Enzyme-linked
immunosorbent assay
I-ELISA pertama kali dikembangkan
menggunakan antigen CAT (lihat di bawah) dan dapat diimplementasikan dimana
bila komersial C-ELISA tidak tersedia. Berbeda dengan C-ELISA, sebagian besar
reagen, seperti buffer dan ready-to dissolve substrates,
tersedia secara komersial di banyak negara. Laboratorium dapat mempersiapkan
antigen dengan menggunakan strain lokal A. marginale I-ELISA menggunakan
sejumlah kecil serum dan antigen, dan sensitivitas dan spesifisitas dari tes
standar dengan benar true positif dan negatif adalah sama baiknya untuk
C-ELISA. Karena dapat disiapkan di setiap laboratorium, hanya prosedur umum
yang dijelaskan di sini (Barry et al., 1986). Untuk kit komersial, petunjuk
pabrik harus diikuti. Dalam kasus in-house I-ELISA,
lihat Barry et al. 1986.
Initial bodies
dan membran diambil untuk complement fixation test (Rogers et al., 1964). Antigen ini diberi perlakuan dengan 0,1% sodium dodecyl sulphate selama 30 menit sebelum dimasukkan antigen ke plate microtitre.
Untuk setiap laboratorium, jumlah antigen spesifik harus disesuaikan untuk
mendapatkan pembacaan yang terbaik dan pengeluaran sedikit.
Hasil tes menggunakan I-ELISA yang
tersedia di sekitar 4 sampai 5 jam. Hal ini dilakukan sebagai berikut:
2.2.1.
reagen uji
Plate
96-well microtitre dicoating dengan A.
marginale antigen,
PBS/Tween
buffer, (PBS 0.1 M, pH 7.2, Tween 20 0.05%),
Blocking
reagent (contoh skim milk bubuk komersial)
Tris
buffer 0.1M, MgCl2, 0.1M, NaCl .005 M, pH 9.8
Substrat
p-Nitrophenyl phosphate disodium hexahydrate
Kontrol positif dan negatif.
2.2.2. Prosedur Uji (Uji
ini dijalankan pada triplicates)
i)
Pelat dapat
dipersiapkan sebelumnya dan disimpan di kondisi kedap udara dengan suhu -20 ° C
ii)
perlahan
lepas plastic pembungkus sebelum menggunakan plate, perlahan jangan sampai
menyentuh dasarnya sehingga dapat merngacaukan dalam pembacaan pembacaan
optical density (OD).
iii)
Lepaskan
tutup dan deposit 200 µl PBST20 solution pada setiap
well dan inkubasi selama 5 menit pada suhu ruang (RT).
iv) Untuk satu plate, larutkan 1,1 g
susu skim (blocking agent) di 22 ml PBST20.
v)
Buang isi plate dan masukkan ke setiap well, 200 μl blocking solution dan tutup
inkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C.
vi)
cuci plate sebanyak 3 kali selama 5 menit dengan PBST20.
vii)
encerkan semua serum termasuk control 1/100 dengan PBST20 solution;
viii)
Buang isi plate dan isi dengan 200 μl serum diluted pada 3 well pada setiap
pengenceran, dimulai dengan kontrol positif dan negative dan blank control.
ix)
Inkubasi
plate pada 37 ° C tertutup selama 60 menit.
x)
Cuci tiga
kali seperti yang dijelaskan dalam vi.
xi)
Encerkan 1/1000 anti-IgG bovine alkaline phosphatase conjugate dengan PBST20
solution; Tambahkan 200 μl diluted conjugate tiap well; inkubasi dengan plate
tertutup pada 37°C selama 60 menit.
xii)
buka tutupnya dan cuci sebanyak 3 kali dengan PBST20.
xiii) kosongkan plate dan masukkan 195 ml 0,075%
p-Nitrophenyl fosfat disodium hexahydrate in buffer Tris dan inkubasi selama 60
menit pada suhu 37 ° C
ix) reaksi
diukur dengan microplate reader spectrophotometer, disesuaikan dengan
panjang gelombang 405 nm. Data diekspresikan dalam bentuk optical density (OD).
2.2.3. Analisa Data
Analisis hasil harus memperhitungkan
parameter berikut.
i) Nilai rata-rata dari blank well.
ii) Mean well positif dengan standar
deviasi masing-masing.
iii) berarti nilai sumur negatif dengan
standar deviasi masing-masing.
iv) nilai rata-rata dari well kosong
dikurangi dari mean dari semua sampel lainnya jika
tidak otomatis dikurangi oleh ELISA
reader.
v) kontrol sera dititrasi untuk
memberikan nilai rerata optical density mulai 0,90-1,50
untuk positif dan, 0,15-0,30 untuk kontrol negatif
nilai positif adalah nilai-nilai yang
lebih tinggi dari nilai cut-off calculated yang merupakan jumlah dari rata-rata
negatif dan dua kali standar deviasi.
untuk tujuan
penilaian konsistensi test operator, kesalahan "E"
juga harus diperkirakan; ini dihitung dengan menentukan persentase diwakili
oleh standar deviasi terhadap rerata serum.
2.3. Card Agglutination Test
keuntungan dari CAT adalah bahwa tes itu
sensitif, dapat dilakukan baik di laboratorium atau di lapangan, dan memberikan
hasil dalam beberapa menit saja. Reaksi nonspesifik mungkin menjadi masalah,
dan subjektivitas dalam menafsirkan reaksi assay dapat mengakibatkan
variabilitas dalam penafsiran tes. Selain itu, antigen CAT, yang merupakan
suspensi partikel A. marginale, dapat sulit dipersiapkan dan dapat bervariasi dari
batch ke batch dan laboratorium ke laboratorium. Anak sapi Splenectomised
terinfeksi oleh inokulasi intravena dengan darah yang mengandung eritrosit yang
terinfeksi Anaplasma. Ketika rickettsaemia melebihi 50%, hewan tersebut
exsanguinated, eritrosit yang terinfeksi dicuci, lysed, dan eritrosit yang
tidak tampak dan partikel Anaplasma yang dipellet. Pelet disonikasi, dicuci,
dan kemudian diresuspensi dalam larutan terwarnai untuk menghasilkan suspensi
antigen.
Prosedur tes
yang telah sedikit dimodifikasi dari yang awalnya (Amerault & Roby, 1968;. Amerault et al,
1972) adalah sebagai berikut, dan berdasar pada kondisi yang terkendali di
laboratorium:
2.3.1. Prosedur tes
i) Memastikan semua komponen uji ada
pada suhu 25-26 ° C sebelum digunakan
(suhu konstan sangat penting untuk uji).
ii) pada setiap lingkaran kartu uji
(yang jelas perspex / plastik atau plate kaca yang ditandai dengan lingkaran
diameter 18 mm), tempat di samping satu sama lain, tetapi tidak saling sentuh, 10 μl of bovine serum factor (BSF), 10 μl
of test serum,
dan 5 μl CAT antigen3. Negatif dan serum
kontrol positif rendah harus diuji pada setiap kartu.
BSF merupakan serum dari hewan yang
dipilih dengan tingkat conglutinin dikenal tinggi. Jika tingkat conglutinin
tidak diketahui, serum segar dari hewan yang sehat diketahui bebas dari
Anaplasma dapat digunakan. BSF harus disimpan pada suhu -70 ° C di aliquot
kecil, aliquot segar yang digunakan setiap kali tes dilakukan. Dimasukkannya
BSF meningkatkan sensitivitas tes.
iii) mix dengan gelas stirrer. Setelah mix tiap uji,
seka stirrer dengan tisu bersih untuk mencegah kontaminasi silang.
iv) tempatkan tes card pada ruangan yang lembab dan
goyang dengan 100–110 rpm selama 7 menit.
v) baca segera dengan latar.
Karakteristik penggumpalan dari antigen (grade dari +1 to +3) dianggap positif.
Tes ini dianggap memberikan hasil negatif ketika tidak ada penggumpalan karakteristik.
2.4.
Complement Fixation Test
fiksasi komplemen (CF)
tes telah digunakan secara luas selama beberapa tahun; Namun, hal itu menunjukkan variabel sensitivitas
(mulai dari 20 sampai 60%), mungkin mencerminkan perbedaan dalam teknik untuk
produksi antigen, dan reproduktifitas rendah. Selain itu, telah dibuktikan
bahwa uji CF gagal untuk mendeteksi perbandingan yang signifikan dari ternak
pembawa (Bradway et al., 2001). Hal ini juga masih diragukan apakah tes CF
dapat mengidentifikasi antibodi pada hewan infeksi akut sebelum tes lainnya atau
tidak(Coetzee et al, 2007;. Molloy et al, 1999.). Oleh karena itu, tes CF tidak
lagi direkomendasikan sebagai assay diandalkan untuk mendeteksi hewan yang
terinfeksi.
2.5. Indirect Fluorescent Antibody Test
Karena keterbatasan
pada jumlah antibodi indirect
fluorescent (IFA) tes yang dapat dilakukan setiap hari oleh satu
operator, tes serologis lainnya umumnya lebih memilih untuk tes IFA. Tes IFA
dilakukan seperti yang dijelaskan untuk Babesiosis sapi dalam bab 2.4.2,
kecuali bahwa darah yang terinfeksi A. marginaIe digunakan untuk persiapan
smear antigen. Sebuah masalah serius yang dihadapi dari tes ini adalah fluoresensi
nonspesifik. Antigen yang berasal dari darah yang dikoleksi mengalami rickettsaemia
(5- 10%) kemungkinan besar sesuai. Fluoresensi nonspesifik karena antibodi
mengikuti eritrosit yang terinfeksi dapat dikurangi dengan mencuci eritrosit
dalam glisin penyangga asam sebelum pap antigen disiapkan. Eritrosit yang
terinfeksi dicuci dua kali dalam 0,1 M glisin penyangga (pH 3,0, disentrifugasi
pada 1000 g selama 15 menit pada suhu 4 ° C) dan kemudian sekali di PBS, pH
7,4. Data baru ini diterbitkan menunjukkan bahwa IFA, seperti C-ELISA, bisa bereaksi
silang dengan anggota lain dari keluarga Anaplasmataceae (Al-Adhami et al.,
2011).
C. SYARAT VAKSINASI
1. Latar Belakang
Beberapa metode imunisasi telah
digunakan untuk melindungi ternak terhadap anaplasmosis di negara-negara di
mana penyakit ini endemik, tapi tidak ada yang ideal untuk tanggal (McHardy,
1984). Sebuah tinjauan A. vaksin marginale dan antigen telah diterbitkan (Kocan
et al., 2003) Penggunaan sedikit patogen A. centrale, yang memberikan
perlindungan silang parsial terhadap A. marginale, adalah metode yang paling
diterima secara luas, meskipun tidak digunakan di banyak negara di mana
penyakit ini eksotis, termasuk Amerika utara.
pada bagian ini, produksi
vaksin A. centrale hidup dijelaskan. Ini melibatkan infeksi yang rentan,
splenectomised pada anak sapi dan penggunaan darah sebagai vaksin. Catatan
rinci prosedur produksi yang tersedia dan referensi harus dilakukan untuk
publikasi ini untuk rincian dari prosedur yang diuraikan di sini (Bock et al,
2004;. De Vos & Jorgensen, 1992; Pipano, 1995).
Pedoman
untuk produksi vaksin hewan diberikan dalam Bab 1.1.6 Prinsip produksi vaksin
hewan. Pedoman yang diberikan di sini dan di Bab 1.1.6 dimaksudkan bersifat
umum dan dapat dilengkapi dengan persyaratan nasional dan regional
Vaksin
centrale Anaplasma dapat diberikan baik dalam bentuk beku atau dingin
tergantung permintaan, jaringan transportasi, dan ketersediaan nitrogen cair
atau persediaan dry ice. Vaksin beku
dianjurkan dalam kebanyakan kasus, karena memungkinkan untuk pengendalian
kualitas pasca-produksi menyeluruh dari setiap batch. Hal ini, bagaimanapun
juga lebih mahal untuk memproduksi dan lebih sulit untuk mengangkut daripada
vaksin dingin. Risiko kontaminasi membuat kontrol pasca-produksi menjadi
penting, tetapi mungkin mahal.
2. Outline produksi
dan syarat minimum untuk vaksinasi konvensional
2.1.
Karakteristik bibit
2.1.1.
Karakteristik Biologi
Anaplasma
centrale diisolasi pada tahun 1911 di Afrika Selatan, dan telah digunakan
sebagai vaksin di Amerika Selatan, Australia, Afrika, Timur Tengah, dan
Tenggara Asia. Vaksin diberikan hanya parsial, tapi memadai, melindungi di
daerah di mana strain ditantang dengan virulensi sedang (misalnya Australia)
(Bock & de Vos, 2001). Di daerah tropis yang lembab di mana A. marginale
tampaknya menjadi rickettsia sangat virulen, perlindungan yang diberikan oleh
A. centrale mungkin tidak memadai untuk mencegah penyakit pada beberapa hewan.
Anaplasma centrale
biasanya menyebabkan infeksi jinak, terutama jika digunakan di anak sapi bawah
usia 9 bulan . Reaksi parah setelah vaksinasi telah dilaporkan ketika sapi
dewasa diinokulasi. Kesesuaian suatu isolat dari A. centrale sebagai vaksin
dapat ditentukan dengan inokulasi ternak yang rentan, memantau reaksi
berikutnya, dan kemudian menantang hewan dan kontrol yang peka dengan lokal
virulen strain A. marginale. Keduanya baik keamanan dan keberhasilan dapat
dinilai dengan memonitor rickettsaemias di film darah yang diwarnai dan penurunan
packed cell
volumes dari ternak yang diinokulasi selama vaksinasi
dan challenge periode reaksi.
Bahan
infektif untuk mempersiapkan vaksin ini siap disimpan seperti pada frozen stabilates darah yang terinfeksi
dalam nitrogen cair atau dry ice.
Dimetil sulfoksida (DMSO) dan polyvinylpyrrolidone MW 40.000 (Bock et al.,
2004) adalah cryopreservatives yang direkomendasikan, karena mereka
memungkinkan untuk pemberian intravena setelah pencairan dari stabilate tersebut. Sebuah laporan rinci
tentang teknik pembekuan menggunakan DMSO dilaporkan di tempat lain (. Mellorset
al, 1982), tapi dengan melibatkan hal-hal berikut: koleksi darah yang
terinfeksi, chilled sampai 4 ° C, dan cold
krioprotektan (4 M DMSO di PBS) ditambahkan perlahan dengan pengadukan ke darah
tersebut: rasio protektan 1: 1, untuk memberikan konsentrasi akhir 2 M DMSO.
Seluruh prosedur pengenceran dilakukan dalam penangas dingin dan darah
diencerkan dibagikan ke dalam wadah yang sesuai (misalnya 5 mI cryovials), dan
beku, sesegera mungkin, dalam wadah pada fase uap dari nitrogen cair.
2.1.2. Kualitas Kriteria
Bukti kemurnian isolate A. centrale dapat ditentukan
oleh pengujian serologis sera dipasangkan dari sapi yang digunakan dalam uji
keamanan untuk kemungkinan kontaminan yang mungkin ada (Bock et al, 2004;.
Pipano, 1997). Anak sapi donor digunakan untuk memperluas benih untuk produksi
vaksin harus diperiksa untuk semua blood-borne infections di negara yang
memproduksi vaksin, termasuk Babesia, Anaplasma, Ehrlichia, Theileria dan
Trypanosoma. Hal ini dapat dilakukan dengan pemeriksaan rutin film darah yang
diwarnai setelah splenektomi, dan sebaiknya juga dengan serologi. Setiap anak
sapi yang menunjukkan bukti infeksi alami dari setiap agen ini harus ditolak.
Tidak adanya agen infeksi lain juga harus dikonfirmasi. Ini mungkin termasuk
agen enzootic bovine leukosis, mucosal disease, infectious bovine rhinotracheitis,
ephemeral fever, Akabane disease, bluetongue, penyakit mulut dan kuku, dan
rinderpest. Prosedur pengujian akan tergantung pada penyakit yang lazim di
negara dan ketersediaan tes, tetapi harus melibatkan serologi dari setidaknya
pasangan sera dan, dalam beberapa kasus, isolasi virus, antigen, atau deteksi DNA
/ RNA (Bock et al. 2004; Pipano, 1981;. 1997)
2.2. Metode
Pembuatan
2.2.1. Prosedur
i) Produksi vaksin
beku
Kuantitas dari stabilate
beku (5-10 ml) yang dicairkan dengan cara merendam botol dalam air dipanaskan
sampai 40 ° C. Materi yang dicairkan disimpan di es dan digunakan sesegera
mungkin (dalam waktu 30 menit) untuk menginfeksi rentan, splenectomised anak sapi dengan inokulasi
intravena.
The rickettsaemia dari
anak sapi donor dipantau setiap hari dengan memeriksa film darah dari jugularis
yang diwarnai , dan darah dikoleksi untuk produksi vaksin saat muncul rickettsaemias
.Sebuah
rickettsaemia dari 1 × 108 / ml (sekitar 2% rickettsaemia dalam darah
jugularis) adalah minimum yang diperlukan untuk produksi vaksin karena ini
adalah dosis untuk memvaksinasi sapi. Jika rickettsaemia yang cocok tidak
diperoleh, bagian dari strain oleh subinoculation dari 100- 200 ml darah ke
anak sapi yang displenectomi kedua mungkin diperlukan.
Darah dari donor dikoleksi
secara aseptis pada jugularis atau kanulasi karotis menggunakan heparin sebagai
antikoagulan (5 International Unit [IU] heparin / ml darah). Penggunaan blood collection units untuk digunakan
manusia juga cocok dan jaminan sterilitas dan meniadakan kebutuhan untuk
mempersiapkan glass flask yang membuat prosedur lebih rumit.
Di laboratorium, darah infektif
dicampur dalam volume yang sama dengan 3 M gliserol di PBS dilengkapi dengan 5
mM glukosa pada 37 ° C (konsentrasi akhir gliserol 1,5 M). Campuran ini
kemudian diseimbangkan pada 37 ° C selama 30 menit dan dikeluarkan ke dalam
wadah yang sesuai (mis 5 ml cryovials). Botol yang didinginkan sekitar 10 ° C /
menit dalam fase uap nitrogen cair dan, ketika membeku, disimpan dalam fase
cair (Bock et al., 2004).
DMSO
dapat digunakan sebagai krioprotektan di tempat gliserol. Hal ini dilakukan
dengan cara yang sama seperti yang diuraikan untuk persiapan stabilate benih
(Mellors et al, 1982;. Pipano, 1981).
Jika vaksin glycerolised harus
diencerkan, pengencer harus terdiri dari PBS dengan 1,5 M gliserol dan 5 mM
glukosa (Jorgensen et al., 1989). Vaksin cryopreserved dengan DMSO harus
diencerkan dengan pengencer yang mengandung konsentrasi yang sama dari DMSO
seperti dalam darah cryopreserved asli (Pipano et al., 1986).
ii) Produksi chilled vaksin
bahan infektif untuk
chilled vaksin disiapkan dengan cara yang sama seperti untuk vaksin beku,
tetapi harus dikeluarkan dan digunakan sesegera mungkin setelah dikoleksi.
Darah infektif dapat didilusi untuk memberikan 1 × 107 parasit per dosis
vaksin. Pengencer yang cocok adalah 10% sapi steril serum dalam / larutan garam
seimbang glukosa yang mengandung kuantitas berikut per liter: NaCI (7.00 g),
MgCI2.6H2O (0,34 g), glukosa (1.00 g), Na2HPO4(2.52
g), KH2PO4(0,90 g), dan NaHCO3
(0,52 g).
Jika pengencer tidak tersedia, asam sitrat
dextrose (20% [v / v]) atau sitrat fosfat dextrose (20% [v / v]) harus
digunakan sebagai antikoagulan untuk memberikan glukosa yang diperlukan untuk
kelangsungan hidup organisme.
iii) Penggunaan vaksin
Dalam
kasus vaksin beku, botol harus dicairkan dengan pencelupan dalam air,
dipanaskan sampai 37 ° C hingga 40 ° C, dan isi dicampur dengan pengencer yang
cocok untuk pengenceran yang diperlukan. Jika vaksin glycerolised disiapkan,
harus tetap dingin dan digunakan dalam waktu 8 jam (Bock et al., 2004). Jika
DMSO digunakan sebagai krioprotektan, vaksin siap harus disimpan di es dan
digunakan dalam waktu 15-30 menit (Pipano, 1981). Vaksin ini paling sering
diberikan secara subkutan.
iv) Chilled vaksin harus disimpan dalam lemari es dan digunakan
dalam waktu 4-7 hari persiapan.
Strain A. centrale
digunakan dalam vaksin adalah untuk mengurangi virulensi, namun tidak sepenuhnya
aman. oleh karena itu, untuk membatasi penggunaan vaksin untuk anak sapi, di
mana imunitas nonspesifik akan meminimalkan risiko reaksi vaksin. Ketika hewan
yang lebih tua harus divaksinasi, ada risiko reaksi yang parah. Reaksi ini
jarang terjadi, tapi nilai pembiakan ternak atau hewan bunting jelas memerlukan
perhatian, dan harus diamati setiap hari selama 3 minggu pasca vaksinasi. Hewan
yang secara klinis menunjukkan sakit harus diobati dengan oxytetracycline atau
imidocarb pada dosis yang direkomendasikan oleh produsen. Kekebalan protektif berkembang
dalam 6-8 minggu dan biasanya berlangsung selama beberapa tahun.
Vaksin anaplasmosis dan
Babesiosis sering digunakan secara bersamaan, tetapi tidak dianjurkan untuk
menggunakan vaksin lain pada waktu yang sama (Bock et al., 2004).
2.2.2. Syarat
Substrat dan Media
Anaplasma centrale tidak bisa dibiakkan secara in vitro.
Tidak ada substrat atau media lain selain buffer dan pengencer yang digunakan
dalam produksi vaksin. DMSO atau gliserol harus dibeli dari perusahaan
terkemuka
2.2.3. Kontrol
selama proses
i) Sumber dan pemeliharaan donor vaksin
Sebuah sumber dari anak
sapi yang bebas dari infeksi alami Anaplasma dan tick-borne disease lainnya
harus diidentifikasi. Jika sumber yang sesuai tidak tersedia, mungkin perlu
untuk mengembang biakkan anak sapi bawah kondisi tick-free secara khusus untuk
tujuan produksi vaksin.
Anak-anak sapi harus
dipertahankan dalam kondisi yang akan mencegah paparan penyakit menular dan
kutu dan serangga penggigit. Dengan tidak adanya fasilitas yang memadai, resiko
kontaminasi dengan agen penyakit menular yang muncul di negara yang terlibat
harus diperkirakan, dan manfaat dari produksi lokal vaksin ditimbang terhadap
konsekuensi yang merugikan dengan kemungkinan penyebaran penyakit (Bock et al.,
2004 ).
ii) Bedah
anak sapi Donor harus displenectomis
untuk memberikan hasil maksimum organisme untuk produksi vaksin. Ini terbaik
dilakukan pada sapi muda dan di bawah anestesi umum.
iii) Screening donor vaksin sebelum inokulasi
Adapun persiapan stabilate
benih, donor anak sapi untuk produksi vaksin harus diperiksa untuk semua prevalensi
blood-borne infection di negara yang memproduksi vaksin, termasuk Babesia,
Anaplasma, Ehrlichia, Theileria dan Trypanosoma. Hal ini dapat dilakukan dengan
pemeriksaan rutin film darah yang diwarnai setelah splenektomi, dan sebaiknya
juga dengan serologi. Setiap anak sapi yang menunjukkan bukti infeksi alami dari
setiap agen ini harus ditolak. Tidak adanya agen infeksi lain juga harus
dikonfirmasi. Ini mungkin termasuk agen enzootic bovine leukosis bovine viral diarrhoea,
infectious bovine rhinotracheitis, ephemeral fever, Akabane
disease, bluetongue, dan penyakit mulut dan kuku. Prosedur pengujian akan
tergantung pada pravalensi penyakit di negara dan ketersediaan tes, tetapi
harus melibatkan serologi dari setidaknya pasangan sera, dan beberapa kasus,
isolasi virus, antigen, atau deteksi DNA / RNA (Bock et al. 2004; Pipano,
1981;. 1997)
iv) Pemantauan rickettsaemias berikut inokulasi
Hal ini diperlukan untuk
menentukan konsentrasi rickettsia dalam darah yang dikumpulkan untuk vaksin.
Konsentrasi rickettsial dapat diperkirakan dari jumlah eritrosit dan rickettsaemia
(persentase eritrosit yang terinfeksi).
v) Koleksi darah untuk vaksin
Semua peralatan harus
disterilkan sebelum digunakan (misalnya dengan autoklaf). Setelah rickettsaemia
yang diperlukan tercapai, darah terkumpul di heparin menggunakan teknik aseptik
yang ketat. Hal ini paling baik dilakukan jika anak sapi dibius dan dengan
penggunaan sistem koleksi closed-circuit.
Hingga 3 liter darah
terinfeksi berat dapat dikumpulkan dari anak sapi 6-bulan. Jika pedet hidup,
transfusi jumlah yang sama dari darah donor yang cocok terindikasi. Atau, anak
sapi harus disembelih segera setelah dilakukan koleksi darah.
vi) Pemberian vaksin
Semua prosedur dilakukan
di lingkungan yang sesuai,Seperti laminar flow cabinet,
menggunakan teknik steril standar. Penggunaan pengaduk mekanik atau magnet stirrer
akan memastikan secara menyeluruh pencampuran darah dan diluent seluruh proses
pengeluaran. Penisilin (500.000 IU / liter) dan streptomisin (370.000 ug /
liter) ditambahkan ke vaksin pada saat meracik.
2.2.4. produk final dan tes batch
Potensi, keamanan dan
sterilitas batch vaksin tidak dapat ditentukan dalam kasus vaksin dingin, dan
spesifikasi untuk vaksin beku tergantung dari negara yang terlibat. Berikut ini
adalah spesifikasi untuk vaksin beku yang diproduksi di Australia.
i) Sterilitas dan kemurnian
tes standar untuk
sterilitas dikerjakan untuk setiap batch vaksin dan pengencer (lihat Bab 1.1.7
Tes untuk sterilitas dan kebebasan dari kontaminasi bahan biologis).
Tidak adanya kontaminan
ditentukan dengan melakukan tes serologis yang sesuai pada sapi donor, dengan
menginokulasikan limfosit donor ke domba dan kemudian dimonitor untuk membuktikan
infeksi virus, dan dengan inokulasi ternak dan monitoring serologinya untuk
agen infeksi yang berpotensi mengkontaminasi vaksin. Sapi diinokulasi selama
uji untuk potensi (lihat Bagian C.2.2.4.iii) sesuai untuk tujuan tersebut.
Tergantung pada negara asal vaksin, agen ini termasuk organisme penyebab
enzootic bovine leukosis, infectious bovine rhinotracheitis, bovine viral diarrhoea,
ephemeral
fever, Akabane disease, virus Aino, bluetongue,
parainfluenza, penyakit mulut dan kuku, lumpy skin disease, , rabies, Rift Valley fever, contagious bovine
pleuropneumonia, penyakit Jembrana, heartwater,
patogen Theileria dan Trypanosoma spp, Brucella abortus, Coxiella, dan
Leptospira (Bock et al, 2004;. Pipano, 1981; 1997). patogen lain sebagai pertimbangan
termasuk agen penyebab bovine tuberculosis dan
brucellosis karena dapat menyebar melalui darah yang terkontaminasi yang
digunakan untuk produksi vaksin. Sebagian besar agen ini dapat diuji dengan
cara PCR spesifik dan ada banyak publikasi yang menggambarkan primer, dan
kondisi assay untuk penyakit tertentu.
ii) Keselamatan
reaksi Vaksin dari ternak yang
diinokulasi dalam tes untuk potensi (lihat Bab 1.1.6 Prinsip produksi vaksin
hewan) dimonitor dengan mengukur rickettsaemia dan penurunan dari packed cell
volume. Hanya batch dengan tingkat patogenisitas yang sama dengan atau lebih
rendah dari standar yang telah ditetapkan dilepaskan untuk digunakan.
iii) Potensi
Vaksin dicairkan dan diencerkan 1/5 dengan pengencer yang cocok
(Bock et al., 2004). Vaksin diencerkan kemudian diinkubasi selama 8 jam pada 4
° C, dan lima sapi diinokulasi subkutan dengan dosis 2 ml. Ternak diinokulasi
dimonitor terhadap munculnya infeksi dengan pemeriksaan ulasan darah yang
diwarnai. Semua harus menjadi terinfeksi untuk batch supaya diterima. Batch yang
terbukti menjadi infektif direkomendasikan untuk digunakan pada pengenceran 1/5
dengan pengencer isotonik.
2.3.
Persyaratan untuk otorisasi
2.3.1. Keamanan
Strain A. centrale yang digunakan
dalam vaksin adalah yang berkurang virulensi, namun tidak sepenuhnya aman. Ini
rekomendasi praktis, karena itu, untuk membatasi penggunaan vaksin untuk anak
sapi, di mana imunitas nonspesifik akan meminimalkan risiko reaksi vaksin.
Ketika hewan yang lebih tua harus divaksinasi, ada risiko reaksi yang parah.
Reaksi ini jarang terjadi, tapi hal yang penting dari pembiakan ternak atau
hewan bunting jelas menjadi perhatian, dan harus diamati setiap hari selama 3
minggu pasca vaksinasi. hewan sakit yang secara klinis harus diobati dengan
oxytetracycline atau imidocarb pada dosis yang direkomendasikan oleh produsen.
Anaplasma centraleTidak
infektif dengan spesies lain, dan vaksin tidak dianggap memiliki efek terhadap lingkungan
lainnya yang merugikan. Vaksin ini tidak infektif bagi manusia. Ketika produk
disimpan dalam nitrogen cair, berlaku tindakan pencegahan yang biasa berkaitan
dengan penyimpanan, transportasi dan penanganan bahan yang dibekukan.
2.3.2. Syarat Keberhasilan
Parsial namun imunitasnya
tahan lama hasil dari satu inokulasi. Tidak ada bukti bahwa vaksinasi berulang akan
memiliki efek meningkatkan. Vaksin ini digunakan untuk mengontrol anaplasmosis
klinis di daerah endemis. Ini tidak akan memberikan kekebalan steril, dan tidak
boleh digunakan untuk pemberantasan A. marginale.
2.3.3. Stabilitas
Vaksin ini dapat disimpan
selama 5 tahun ketika disimpan dalam nitrogen cair. Setelah dicairkan, dengan
cepat kehilangan potensinya. Vaksin dicairkan tidak dapat dibekukan kembali.
3. Vaksin berdasarkan bioteknologi
Tidak ada vaksinasi
berdasarkan bioteknologi yang tersedia untuk anaplasmosis
REFERENSI
AL-ADHAMI
B., SCANDRETT W.B., LOVANOV V.A. & GAJADHAR A.A. (2011). Serological cross
reactivity between Anaplasma marginale and Ehrlichia species in
naturally and experimentally infected cattle. J. Vet. Diagn. Invest., 23,
1181–1188.
AMERAULT
T.E. & ROBY T.O. (1968). A rapid card agglutination test for bovine
anaplasmosis. J. Am. Vet. Med. Assoc., 153, 1828–1834.
AMERAULT
T.E., ROSE J.E. & ROBY T.O. (1972). Modified card agglutination test for
bovine anaplasmosis: evaluation with serum and plasma from experimental and
natural cases of anaplasmosis. Proc. U.S. Anim. Health Assoc., 76,
736–744.
BARRY
D.N., PARKER R.J., DE VOS A.J., DUNSTER P. & RODWELL B.J. (1986). A
microplate enzyme-linked immunosorbent assay for measuring antibody to Anaplasma
marginale in cattle serum. Aust. Vet. J., 63, 76–79.
BOCK
R., JACKSON L., DE VOSA. & JORGENSEN W. (2004). Babesiosis of cattle. Parasitology,129,
Suppl, S247–269.
BOCK
R.E. & DE VOS A.J. (2001). Immunity following use of Australian tick fever
vaccine: a review of the evidence. Aust. Vet. J., 79, 832–839.
BRADWAY
D.S., TORIONI DE ECHAIDE S., KNOWLES D.P., HENNAGER S.G. & MCELWAIN T.F.
(2001). Sensitivity and specificity of the complement fixation test for
detection of cattle persistently infected with Anaplasma marginale. J.
Vet. Diagn. Invest., 13, 79–81.
CARELLI
G., DECARO N., LORUSSO A., ELIA G., LORUSSO E., MARI V., CECI L. &
BUONAVOGLIA C. (2007). Detection and quantification of Anaplasma marginale DNA
in blood samples of cattle by real-time PCR. Vet. Microbiol., 124,
107–114.
COETZEE
J.F., SCHMIDT P.L., APLEY M.D., REINBOLD J.B. & KOCAN K.M. (2007).
Comparison of the complement fixation test and competitive ELISA for serodiagnosis
of Anaplasma marginale infection in experimentally infected steers. Am.
J. Vet. Res., 68, 872–878.
CHUNG
C., WILSON C., BANDARANAYAKA-MUDIYANSELAGE C.-B., KANG E., ADAMS D.S.,
KAPPMEYER L.S., KNOWLES D.P., MCELWAIN T.F., EVERMANN J.F., UETI M.W., SCOLES
G.A., LEE S.S. & MCGUIRE T.C. (2014). Improved diagnostic performance of a
commercial Anaplasma antibody competitive enzyme-linked immunosorbent
assay using recombinant major surface protein 5-glutathione S-transferase
fusion protein as antigen. J. Vet. Diagn. Invest., 26, 61–71.
DECARO
N., CARELLI G., LORUSSO E., LUCENTE M.S., GRECO G., LORUSSO A., RADOGNA A.,
CECI L. & BUONAVOGLIA C. (2008). Duplex real-time polymerase chain reaction
for simultaneous detection and quantification of Anaplasma marginale and
Anaplasma centrale. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 606–611.
DE
VOS A.J. & JORGENSEN W.K. (1992). Protection of cattle against babesiosis
in tropical and subtropical countries with a live, frozen vaccine. In:Tick
Vector Biology, Medical and Veterinary Aspects, Fivaz B.H., PetneyT.N. &
Horak I.G., eds. Springer Verlag, Berlin, Germany, 159–174.
DREHER
U.M., DE LA FUENTE J., HOFMANN-LEHMANN R., MELI M.K., PUSTERIA N., KOCAN K.M.,
WOLDEHIWET A., REGULA G. & STAERK K.D.C. (2005). Serologic cross reactivity
between Anaplasma marginale and Anaplasma phagocytophilum. Clin.
Vaccine. Immunol., 12, 1177–1183.
DUMLER J.S., BARBET A.F., BEKKER C.P.,
DASCH G.A., PALMER G.H., RAY S.C., RIKIHISA Y. & RURANGIRWA F.R. (2001).
Reorganization of genera in the Families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in
the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with
Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia, and Ehrlichia with
Neorickettsia, descriptions of five new species combinations and
designation of Ehrlichia equi and „HGE agent‟ as subjective synonyms of Ehrlichia
phagocytophila. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 51,
2145–2165.
JORGENSEN
W.K., DE VOS A.J. & DALGLIESH R.J. (1989). Infectivity of cryopreserved Babesia
bovis, Babesia bigemina and Anaplasma centrale for cattle after
thawing, dilution and incubation at 30°C. Vet. Parasitol., 31,
243–251.
KOCAN
K.M., DE LA FUENTE J., BLOUIN E.F. & GARCIA-GARCIA J.C. (2004). Anaplasma
marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae): recent advances in defining host-pathogen
adaptations of a tick-borne rickettsia. Parasitology, 129,
S285–S300.
KOCAN
K.M., DE LA FUENTE J., GUGLIELMONE A.A. & MELENDÉZ R.D. (2003). Antigens
and alternatives for control of Anaplasma marginale infection in cattle.
Clin. Microbiol. Rev., 16, 698–712.
KNOWLES
D., TORIONI DE ECHAIDE S., PALMER G., MCGUIRE T., STILLER D. & MCELWAIN T.
(1996). Antibody against an Anaplasma marginale MSP5 epitope common to
tick and erythrocyte stages identifies persistently infected cattle. J.
Clin. Microbiol., 34, 2225–2230.
KREIER
J.P. & RISTIC M. (1963). Anaplasmosis. X Morphological characteristics of
the parasites present in the blood of calves infected with the Oregon strain of
Anaplasma marginale. Am. J Vet. Res., 24, 676–687.
HOFMANN-LEHMANN
R., MELI M.L., DREHER U.M., GÖNCZI E., DEPLAZES P., BRAUN U., ENGELS M.,
SCHÜPBACH J., JÖRGER K., THOMA R., GRIOT C., STÄRKK.D.C., WILLI B., SCHMIDT J.,
KOCAN K.M. & LUTZ H. (2004). Concurrent infections with vector-borne
pathogens associated with fatal haemolytic anemia in a cattle herd in
Switzerland. J. Clin. Microbiol., 42, 3775–3780.
MCHARDY
N. (1984). Immunization against anaplasmosis: a review. Prev. Vet. Med., 2,
135–146.
MELLORS
L.T., DALGLIESH R.J., TIMMS P., RODWELL B.J. & CALLOW L.L. (1982).
Preparation and laboratory testing of a frozen vaccine containing Babesia
bovis, Babesi abigemina and Anaplasma centrale. Res. Vet.
Sci., 32, 194–197.
MOLLOY
J.B., BOWLES P.M., KNOWLES D.P., MCELWAIN T.F., BOCK R.E., KINGSTON T.G.,
BLIGHT G.W. & DALGLIESH R.J. (1999). Comparison of a competitive inhibition
ELISA and the card agglutination test for detection of antibodies to Anaplasma
marginale and Anaplasma centrale in cattle. Aust. Vet. J., 77,
245–249.
PIPANO
E. (1981). Frozen vaccine against tick fevers of cattle. In: Xl
International Congress on Diseases of Cattle, Haifa, Israel. Mayer E., ed.
Bregman Press, Haifa, Israel, 678–681.
PIPANO
E. (1995). Live vaccines against hemoparasitic diseases in livestock. Vet.
Parasitol., 57, 213–231.
PIPANO
E. (1997). Vaccines against hemoparasitic diseases in Israel with special
reference to quality assurance. Trop. Anim. Health Prod., 29 (Suppl.
4), 86S–90S.
PIPANO
E., KRIGEL Y., FRANK M., MARKOVICS A. & MAYER E. (1986). Frozen Anaplasma
centrale vaccine against anaplasmosis in cattle. Br. Vet. J., 142,
553–556.
REINBOLD
J.B., COETZEE J.F., HOLLIS L.C., NICKELL J.S., RIEGEL C.M., CHRISTOPHER J.A.
& GANTA R.R. (2010a). Comparison of iatrogenic transmission of Anaplasma
marginale in Holstein steers via needle and needle-free injection
techniques. Am. J. Vet. Res., 71, 1178–1188.
REINBOLD
J.B., COETZEE J.F., SIRIGIREDDY K.R. & GANTA R.R. (2010b). Detection of Anaplasma
marginale and A. phagocytophilum in bovine peripheral blood samples
by duplex real-time reverse transcriptase PCR assay. J. Clin. Microbiol., 48,
2424–2432.
ROGERS
T.E., HIDALGO R.-J. & DIMOPOULLOS G.T. (1964). Immunology and serology of Anaplasma
marginale. I. Fractionation of the complement-fixing antigen. J.
Bacteriol., 88, 81–86.
STICH R.W., OLAH G.A., BRAYTON K.A.,
BROWN W.C., FECHHEIMER M., GREEN-CHURCH K., JITTAPALAPONG S., KOCAN K.M.,
MCGUIRE T.C., RURANGIRWA F.R. & PALMER G.H. (2004).Identification of a
novel Anaplasma marginale appendage-associated protein that localizes
with actin filaments during intraerythrocytic infection. Infect Immun., 72,
7257–7264.
STIK
N.I., ALLEMAN A.R., BARBET A.F., SORENSON H.L., WANSLEY H.L., GASCHEN F.P.,
LUCKSCHANDER N., WONG S., CHU F., FOLEY J.E., BJOERSDORFF A., STUEN S. &
KNOWLES D.P. (2007). Characterization of Anaplasma phagocytophilum major
surface protein 5 and the extent of its cross-reactivity with A. marginale.
Clin. Vaccine Immunol., 14, 262–268.
TORIONI DE ECHAIDE S., KNOWLES D.P.,
MCGUIRE T.C., PALMER G.H., SUAREZ C.E. & MCELWAIN T.F. (1998). Detection of
cattle naturally infected with Anaplasma marginale in a region of
endemicity by nested PCR and a competitive enzyme-linked immunosorbent assay
using recombinant major surface protein 5. J. Clin. Microbiol., 36,
777–782.
